Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (MMLV-RT)

MMLV-RTのユニット定義は殆どのメーカーで同じですが、full-length cDNAの合成に必要な酵素の量は幅広く異なっています。他社ではcDNAの合成にMMLV-RTの300ユニット以上の使用をすすめていますが EpicentreのMMLV-RTは僅か5ユニットでfull length cDNAを合成します。MMLV-RTはRNA及びDNA依存性DNA合成酵素で、プライマーがバイブリダイズする一本鎖RNA鋳型からcDNAの第一鎖を合成します。

MMLV-RTは又、一本鎖DNAにバイブリダイズしたプライマーを伸長させます。第二鎖cDNAは、追加のDNA合成酵素を加えることなくmRNAから合成できます。MMLV-RTは3'-5'エキソヌクレオリテック校正機能は無く、Avian Myeloblastosis Virus(AMV)逆転写酵素と比べ弱いRNase H活性を示します。標準的反応条件では、μgRNA鋳型当り僅か5ユニットのMMLV-RTでfull-length cDNAが合成できます。 (他社では300U以上必要)

• プライマーmRNA鋳型から第一鎖cDNAの合成に
• RT-PCR増幅反応のための鋳型の作製に
• RNA,DNA鋳型を用いたジデオキシ法シークエンスに
• プライマー伸長分析によるmRNA 5'-末端マッピングに
• ラジオアクティブcDNAプローブの合成に
• DNAの3'-末端ラベリングに

cDNA合成を成功させるためには内因性及び混在RNase活性の特性を考慮しなければな りません。未修飾MMLV-RTは、RNA:DNAハイブリットのRNA鎖を変性させるRNase H活性は低いものです。このRNase H活性は、AMV-RTと比べ非常に弱いものです。AMV-RTがもつ高水準のRNase HはcDNAの長さと全生産量を制限します。MMLV-RTは 内因性DNAエキソヌクレアーゼ活性はありません。

10X反応液添付

反応液組成

10 X Reaction Buffer and DTT: 0.5mM Tris-HCl, pH8.3, 0.1mM MgCl₂, 0.75M KCl add DTT(10mM final concentration) and dNTPs(500μM/ each) to reaction

保存温度

-20℃

保存液組成

50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1M NaCl, O.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% Triton X-100, 50% glycerol

活性の定義

鋳型としてオリゴ(dT)12-18プライマーPoly(A)nを用いて、37℃、10分間に1nmoleのdTTPを酸不溶物質に取り込ませる酵素量を1unitとする。

Figure 4.

Epicentre社の MMLV-RT と他社のRNase H- MMLV-RTとの比較
Lane 1, kb ladder
Lane 2, 酵素なしで30分間インキュベート
Lanes 3-4, RNaseH- MMLV-RTを含んだ2.1kb mRNA template 1 μgを15分インキュベート(Lane 3)、30分インキュベート(Lane 4)
Lanes 5-6, Epicentre社の MMLV-RT を含んだ2.1kb mRNA template 1 μgを15分インキュベート(Lane 5)、30分インキュベート(Lane 6)

• dNTPs
• MasterAmp™ High Fidelity RT-PCR Kit
• MasterAmp™ Real-Time RT-PCR System
• MasterAmp™ RT-PCR Kit