ProteoHook™ 2DE Sample Preparation Kit

ProteoHook™ 2DE kitとは

ProteoHook™ 2DE kitを用いることで細胞の溶解とタンパク質の可溶化が高効率で行えます。細胞抽出液をProteoHook™と混合させ、その後ProteoHook™ resinを含むスピンカラムにロードします。タンパク質以外の不純物はwash bufferで洗浄し、遠心することですべて除去されます。タンパク質はその後elution bufferを加えることで回収されます。

Totalタンパク質の細胞中の比率は回収後も維持されます。最終的なタンパク質抽出液には不純物がなく、しかもこの抽出液は濃縮されています。精製したタンパク質サンプルは高品質なプロテオーム解析に用いることができます。

ProteoHook™ 2DE kitの特徴1 - タンパク質の存在比を維持します

溶液中のさまざまなタンパク質の相対比が維持されること、すなわちどのタンパク質に対してもバイアスがかからないことがtotalタンパク質のサンプル調製の際に重要な要素となります。調製途中でタンパク質を一度沈殿させている他社の製品の場合、溶液中のタンパク質によって沈殿・再溶解の特性が異なりますので、溶液中のタンパク質の存在比が変わってしまい、その結果実験の再現性が低下するということが知られています。

一方、このProteoHookはすべてのタンパク質に共通する性質を用いています。ProteoHook 2DE sample preparation kitによって99.5%以上のタンパク質の存在比が維持されるということが次ページの実験によって示されました。

図1：タンパク質精製後もタンパク質の存在比が維持されます

図1はProteoHookによってタンパク質の存在比が維持されることを示したものです。ProteoHook 2DE sample preparation kitで処理したタンパク質サンプルと未処理のタンパク質を2D-DIGEによって比較しました。

250 ugのDrosophilaの胚由来の2つのタンパク質サンプルをProteoHook 2DE sample preparation kitで処理したサンプルをCy5で、未処理のサンプルをCy3でそれぞれラベルしました。その後、処理したサンプルと未処理のサンプルを等量混ぜて同じ2DEゲルで分離しました。

図1ではゲル中のCy3 (緑) とCy5 (赤) の像を重ね合わせています。両方のサンプルが同一の場合、そのスポットは (緑+赤 =) 黄色になります。一方、2つのサンプル間で異なる場合は緑もしくは赤のスポットになります。しかし、2つの色素間でタンパク質のラベル化の効率が異なる場合もありますので、逆のラベル化をした条件での解析を行うことによって単なるラベル化の効率の違いによるartifactと2つのサンプル間でみられた本当の違いを区別できるようになります。

上記の泳動結果の解析ならびにラベル化を逆にした条件での解析を行ったところ、ゲル中に見られる1500のタンパク質のスポットのうち処理したサンプルと未処理のサンプルの間で異なっていると判定されたのはわずか9個でした。これは全タンパク質の0.06%にあたります。しかも、これら9種類のタンパク質の存在比の変化は2倍以下もしくは1/2以上という程度の小さなものでした。

ProteoHook™ 2DE kitの特徴1 - 核酸 (DNA) とSDSを効率的に除去します

2DEの泳動結果に影響のあるSDSとDNAをProteoHook 2DE sample preparation kitが除去する能力を、放射性同位元素で標識されたSDSとDNAを用いて調べました。その結果、図2のように、98〜99%のSDSとDNAが効率よく除去されました。

図2：ProteoHook 2DE sample preparation kitによってDNAおよびSDSは効率的に除去されます

ProteoHook™ 2DE sample preparation kitを用いた様々なアプリケーション例

ProteoHook 2DE sample preparation kitがSDSを効率良く除去することで、下記のように、多くのタンパク質をゲル中で泳動でき、しかもタンパク質のスポットの解像度がよくなる結果につながります。

SDS（1%）を含む緩衝液で調製したDrosophila Embryoの抽出液をProteoHook™ kit および他社製品で処理したときの2DEの結果の比較

他社製品の場合
スポット数は少なく、しかもスメアーになります

ProteoHook™ kitの場合
スポット数は多く、解像度もよくなります

Hela細胞 の抽出液をProteoHook™ kitおよび他社製品で処理したときの2DEの結果の比較

他社製品の場合
タンパク質ローディング地点に多くのタンパク質が残っているため、ゲル中で泳動できるタンパク質の量が少なくなってしまいます

ProteoHook™ kitの場合
タンパク質ローディング地点に残っているタンパク質が少なく、ゲル中で泳動できるタンパク質の量が多くなります

E.coli細胞 の抽出液をProteoHook™ kitおよび他社製品で処理したときの2DEの結果の比較

他社製品の場合
スポット数が少なく、解像度も鮮明ではありません

ProteoHook™ kitの場合
スポット数が多く、解像度もより鮮明です

ProteoHookキットでサンプルを処理した後にDIGEを用いて、サンプル間のタンパク質の量の違いを調べました

異なるDrosophilaの抽出液に、それぞれ0.5ugおよび1ugのBSAを加え、ProteoHookでのサンプル処理と同時にCy3もしくはCy5でのラベリングを製品のdata sheetに基づいて行いました。Cy3とCy5の蛍光を重ね合わせたものが左の写真になります。タンパク質のほとんどがサンプル間で量が変化しませんので黄色く見えます。一方、サンプル間で量が変化するものは量の変化のしかたに応じて赤もしくは緑に見えます。また、白い四角で囲まれた部分はBSAは添加したBSAです。サンプル間で濃度が2倍異なりますので、サンプル間で濃度が変化したものと同じように見えます。ただし、タンパク質によっては2つの蛍光色素によるラベリングの効率に違いがある場合もありますので、ラベルする色素を互いに逆にすることでサンプル間に生じた本当の違いとラベリングの効率の違いによるartifactを区別することができるようになります。ラベリングの方法が互いに逆になる2つのゲルの解析を行った結果、量を変えてサンプルに添加したBSAのみがサンプル間で異なる唯一のタンパク質であることが示されました。

データシート［PDF 629KB］

製品のご購入・ご相談はTEL:03-3545-5720、またはお問い合わせまで。