Ready-Lyse™ Lysozyme Solution

酵素・溶液

E.coliやグラム陰性菌の溶菌に、卵白リゾチームよりもより多くの利点があります。

• 溶菌反応当たりの活性が200倍以上
• 最適pHが中性

卵白リゾチームは中性pHでプラス電荷を持つため、DNA,RNAやマイナス電荷蛋白質と結合し沈澱させ溶菌効率を低めます。それに対してReady-Lyse™は1/200量を加えればよいため、この非特異的沈澱による収率の低下を生じません。

アプリケーション

• グラム陽性菌（表1）を溶菌してタンパク質精製に
• 細菌から核酸を精製

Ready-Lyse™ Lysozyme Solutionは非哺乳類・非鳥類由来の組み換えリゾチームで、グラム陰性菌（E.coliなど）やグラム陰性菌（Bacillus sp.など）の溶菌に使用できます。Ready-Lyse™ Lysozyme Solutionの比活性は卵白リゾチームと異なり-20℃でも安定であるため、使用するたびに溶液を新たに調整する必要はありません。Ready-Lyse Lysozymeを使用すれば、標準的な卵白リゾチームを使用した場合に得られるタンパク質よりも高い収率でタンパク質を調整できます。

表1　 Ready-Lyse™ Lysozyme Solutionで溶菌した細菌

保存温度

-20℃

保存液組成

50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.1M NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT 0.1% TritonX-100を含む50% glycero1

活性の定義

50mM Tris-HCl, pH7.5溶液に浮遊した0.5mg/mlの凍結乾燥E.coli K802を25℃で、1分間当たり0.001 A350減少させる活性を1unitとする。

References

Sambrook, Dritsch and Maniatis (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edit.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

1995 Epicentre Forum 2(4),6

Table 1.In-Well Lysis Screeningプロトコール

1. 丸底microtiter plateウェルにプロトプラストバッファー15 μlをピペットする。 一度に25-50ウェルのものが使いやすいです。）
2. ランダムにホワイトコロニーを滅菌爪楊枝で取ります。
3. microtiter plateウェルの中にあるプロトプラストバッファー (Table 2)の中で10−15秒、爪楊枝をかき回します。Patch bacteria from the same 同じ爪楊枝を使い寒天プレートにレプリカを作成します。 プレートを37℃ overnightインキュベートし、4℃保存しておきます。
4. プロトプラスト形成を促すためにmicrotiter plate を室温、10 分間インキュベーションします。
5. インキュベーションしている間に、（インサートDNAに適切な濃度の）アガロースゲルのウェルににライシスバッファー(Table 2) 4-8 μlを加えます。DNA size markerとしてsupercoiled kb ladder (Life Technologies-BRL)を用います。ウェルを15分間インキュベートします。
   電気泳動によってDNA fragmentsを分画します。（インサートの長さによって電気泳動時間は異なります。）エチジウムブロマイドで染色します。

Table 2.プロトプラストバッファー/ライシスバッファー

プロトプラストバッファー Concentration/Quantity

（-20℃保存）

• 2.0 M Tris-HCl, pH 7.5 0.375 ml 30 mM
• 0.5 M EDTA 0.25 ml 5 mM
• 5.0 M NaCl 0.25 ml 50 mM
• Sucrose 6.25 g 25 %
• 2 mg/ml RNase A 0.31 ml 25 mg/ml
• Ready-Lyse™ Lysozyme : 2 x10⁶ U
• Water to 25 ml

ライシスバッファーVolume

（室温保存）

• 50X TAE buffer* 0.2 ml
• 10% SDS 2.0 ml
• Sucrose 0.5 g
• Bromphenol Blue 15 mg
• Water to 10 ml

*TAE Buffer is 0.04 M Tris-Acetate, 1 mM EDTA.

Figure 1.

pUC19に5.3 kbインサートDNAをライゲーションし、 In-well lysis Screeningしました。 コロニーの80%以上インサートDNAを含んでいます。

Figure 2.

細菌染色体DNAライブラリーのIn-well lysis Screening。 DNA insert size is between 4 and 6 kb. 100% of the screened transformants contained inserts of the expected sizes.

Figure 3.

Lysis with Ready-Lyse™ Lysozyme を用い核酸と蛋白質の回収の増加。 pHC79 cosmid DNA 500 μg/mlは Ready-Lyse™ Lysozyme 5μg (30kU)/ml or 卵白リゾチーム 500 μg/mlを含むTE buffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA) 中で22℃、15分インキュベーションしました。 溶液は10分間、遠心分離し、ペレットは0.1% SDSを含むTE bufferで再溶解しました。 DNAは0.8%アガロースゲルで電気泳動しました。 EWは卵白リゾチーム処理したもの。DNAの約50%はegg white lysozyme の沈殿により失われています。 RLは Ready-Lyse Lysozyme 処理したもの。コントロール(C)リゾチム未処理と比較して最小の沈殿損失を示しています。

Figure 4.

グラム陽性細菌のReady-Lyse™™ Lysozyme処理 LB mediumを用いて50 ml overnight培養したB. subtilis cells の 1 ml集菌1 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.で再溶解し、Ready-Lyse Lysozyme Solution (14,000 U/μl) を加えました。 350 nm吸収を測定し、処理時間、Ready-Lyse™ Lysozymeの添加量（1μl、3μl、5μl） との関係を示しています。

プロトコール

Ready-Lyse™ Lysozyme Solution

• PeriPreps™ Periplasting kit (for periplasmic proteins)
• MasterPure™ Gram Positive DNA Purification Kit

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